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點擊次數(shù)：15228 發(fā)布時間：2013/9/18 10:41:29
免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質(zhì)印跡（western blot），它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡（western blot）具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡（western blot）常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。
主要實驗步驟如下：
1. 蛋白質(zhì)抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。
實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106~1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。
3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳（SDS-PAGE）：將準備好的樣品液和預染蛋白marker分別上樣，標準加進個孔中，電泳分離蛋白。
4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜。
5. western blot膜的封閉和抗體孵育
膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。
封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合。
加入HRP標記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗 體可同時檢測GAPDH含量。
6. western blot結(jié)果檢測：化學發(fā)光法檢測，膜與化學發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯 影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。
7. western blot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH/Actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。
8. 提供實驗報告，包括詳細的實驗方法及免疫印跡實驗結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。
原創(chuàng)作者：上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司
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