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技術(shù)文章

ELISA實(shí)驗(yàn)通關(guān)秘籍,快來(lái)Pick

點(diǎn)擊次數(shù)：14576 發(fā)布時(shí)間：2020/9/28 9:12:23

實(shí)驗(yàn)原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。

實(shí)驗(yàn)材料：抗原，血清。

儀器、耗材：96孔酶標(biāo)板 4℃冰箱恒溫培養(yǎng)箱分光光度計(jì)

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、包被抗原

1. 用50mM 的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原濃度為10-20 μg/ml，加100 μl/孔到96 孔酶標(biāo)板，4℃放置過(guò)夜。

2. 第二天棄去包被液后，用PBST 洗滌3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封閉1 小時(shí)。

3. PBST 洗滌3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 小時(shí)。

4. PBST 洗滌5 次后，加入100μl 稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 小時(shí)。

5. PBST 洗滌5 次后，顯色劑顯色20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取A405 吸收值。

二、包被細(xì)胞

1. 在96 孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為1 x 104 cells/well，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

2. 第二天用PBS 洗滌培養(yǎng)板2-3 次。

3. 加入125 μl/well 10% Forma lin（1:10 稀釋）, 室溫下固定15 min。

4. 用ddH2O 洗滌培養(yǎng)板3 次，并晾干，儲(chǔ)藏在2-8℃?zhèn)溆谩?br />
5. 用PBST 洗滌3 次，每孔加入150 μl 1％ BSA 37℃封閉1 小時(shí)。

6. PBST 洗滌3 次后，每孔加入100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 小時(shí)。

7. PBST 洗滌5 次后，加入100 μl 稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗,37℃孵育1 小時(shí)。

8. PBST 洗滌5 次后，顯色劑顯色20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取A405 吸收值。50mM 的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6 碳酸緩沖液,4℃，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸餾水稀釋至100 ml。

注：ABTS 作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)(10ml)：0.2M Na2HPO4 2.4ml；0.1M 檸檬酸2.6ml；ddH2O 5ml；ABTS 5mg；H2O2(30%) 4 ul（用前加入）。

注意事項(xiàng)：血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩�；鞚峄蛴谐恋淼难鍢�(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。