1、如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？ 
培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長�？傊�，MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始。 
2、何時須更換培養(yǎng)基？ 
視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。 
3、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。 
4、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 
不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。 
5、何謂FBS, FCS, CS, HS ? 
FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。 CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。 
6、培養(yǎng)細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 
一 般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2 濃度。當培 養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用 5 % CO2 培養(yǎng)細胞。 
7、Hank＇s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank＇s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle＇s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？ 
HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2 平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組 織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。 
8、細胞之接種密度為何？ 
依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長重要原因。 
9、懸浮性細胞應如何繼代處理？ 
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。 
10、冷凍管應如何解凍？ 
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 
11、細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時， 是否應馬上去除DMSO？ 
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 
12、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機
13、欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？ 
欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。 
14、細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 
動 物細胞冷凍保存時*常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長用 之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。 
15、DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 
冷 凍保存使用之DMSO 等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即為無菌狀況， 第 一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾 DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。 
16、冷凍保存細胞之方法？ 
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ （-20 °C30 分鐘*） → -80 °C 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 
冷 凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲 存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。 
17、細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？ 
冷凍管內細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 
18、培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 
除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。 
19、應如何避免細胞污染？ 
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。 
20、如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？ 
原則上：直接滅菌后丟棄之。 
當重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。 
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。 
（1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。 
（2）分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 
（3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。 
（4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代。 
（5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。 
（6）重復步驟4。 
（7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。 
21、支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 
不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。 
22、支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？ 
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。 
23、偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。 
24、CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。 
25、為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 
培 養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中， 培養(yǎng)基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色 也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。 
26、各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。 
27、購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形？ 
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 
28、購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 
研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。
29、L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ 
L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有*終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。 
30、GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ 
GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有*小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 
31、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 
酚 紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類 反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 
32、如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？ 
用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升細胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色細胞是死細胞。 
33、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 
丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 
34、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。 
35、室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？ 
緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值。 
50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同PH值 
4°C  25°C   37°C 
8.1      8.5      7.2 
8.2      7.6      7.3 
8.3      7.7      7.4 
8.4      7.8      7.5  
8.5      7.9      7.6  
8.6      8.0      7.7 
8.7      8.1      7.8 
8.8      8.2      7.9 
8.9      8.3      8.0
9.0      8.4      8.1 
9.1      8.5      8.2 
9.2      8.6      8.3 
9.3      8.7      8.4 
9.4      8.8   8.5
36、如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？ 
我們推薦使用脫落細胞的方法，此技術破壞性*小，生活力。通過使用巴斯德吸液管，讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。 
37、胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞： 
（1）去除培養(yǎng)基。 
（2）用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS。 
（3）加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。 
（4）37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。 
（5）向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。） 
（6）離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。 
（7）用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。 
38、在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？ 
為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。 
39、在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？ 
通常情況當細胞經(jīng)過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。 
40、貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫? 
這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。 
41、細胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？ 
如果細胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。 
42、無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？ 
當在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。 
43、培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？ 
一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 
44、培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎？ 
大部分添加物和試劑*多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。 
45、為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液? 
胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。 
46、保存血清的方法? 
我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇�容器內，再放回冷凍�?nbsp;
47、如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質量受損? 
將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。 
48、血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理? 
血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但*普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質量。 
若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內一起過濾。不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞過濾膜。 
49、為什么要熱滅活血清? 
加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究，培養(yǎng)ES細胞、平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。 
50、有必要做熱滅活嗎? 
實 驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫 處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常 會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。 
若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質量! 
51、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀? 
有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。 
52、如何避免沉淀物的產(chǎn)生? 
我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作: 
（1）解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20℃至4℃至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如-20℃至37℃），非常容易產(chǎn)生沉淀物。 
（2）解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。 
（3）請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。 
（4）血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。 
（5）若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

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