僅在一定條件下酶反應(yīng)速度v才和酶量成正比例。一定條件是什么？這些條件之間有無(wú)主次關(guān)系？如何選擇合適的測(cè)定條件？這些都是實(shí)驗(yàn)室工作者在設(shè)計(jì)或選擇測(cè)酶活性濃度方法時(shí)必須面對(duì)的問(wèn)題。

　　首先可從理論上探討在什么特定情況下的反應(yīng)速度才可能與酶量成正比例。酶的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可簡(jiǎn)化如下：

　　式中Kp可看成為ES的解離常數(shù).Michaclis和Menten通過(guò)推導(dǎo)可得出下式方程式

　　此式中V為反應(yīng)速度，對(duì)一定濃度的酶而言為一常數(shù)。Km為實(shí)驗(yàn)室工作所熟系的米氏常數(shù)。上式也可改寫(xiě)為：

　　Kp和Km雖為常數(shù)，但[S]為變量，因此在一般情況下不可能為常數(shù)，即v≠k[E]，從理論上很清楚說(shuō)明反應(yīng)速度v和酶量E之間在絕大多數(shù)條件下只存正比，即v∝[E]。而非正比例關(guān)系。但在底物[S]濃度很大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)Km的特殊條件下Km值由于相對(duì)很小可忽略不計(jì)。此式可變?yōu)椋?/p>

　　由于底物[S]濃度很大，使酶飽和。ES已達(dá)極限，反應(yīng)速度不再增加，故此時(shí)反應(yīng)速度為反應(yīng)V。即從理論上說(shuō)只有測(cè)定的是酶反應(yīng)V。此時(shí)反應(yīng)速度才和酶量E成正比例。也只有在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的測(cè)定方法才是可靠的、準(zhǔn)確的。

　　Kp是酶學(xué)中很重要的一個(gè)常數(shù)，即周轉(zhuǎn)數(shù)（Turnover number），從上式可得出。

　　其含義為每分鐘每分子酶轉(zhuǎn)換底物分子數(shù)。酶的Kp數(shù)值約在50-105min^-1之間。碳酸酐酶是目前已知酶變率的酶（36×10^-6min^-1）。Kp的倒數(shù)代表每一酶催化循環(huán)的時(shí)間，以碳酸酐酶為例

　　1/Kp=lmin/136×106＝0.028×10^－6min＝1.7μs

　　即每隔1.7μs，一分子酶就和一個(gè)底物結(jié)合，反應(yīng)一次。

　　臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）和不少?lài)?guó)家包括我國(guó)的一些學(xué)會(huì)建立了或正在建立測(cè)定酶活性濃度的推薦或參考方法。都毫無(wú)例外地提出測(cè)酶活性濃度方法所選擇的測(cè)定條件應(yīng)是酶反應(yīng)的“*適條件”以保證酶具有的催化活性。實(shí)質(zhì)上就是基于以上理論考慮，要測(cè)定酶的反應(yīng)速度V。

　　我國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)文件中對(duì)*適條件是這樣提出：①選合適的底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類(lèi)和濃度。②指示酶和輔助酶的種類(lèi)和濃度。③反應(yīng)混合液的*適pH，緩沖液種類(lèi)和濃度。④其它影響酶活性的因素，如去除各種抑制劑。并提出：在某些情況下，為了獲得更好的測(cè)定重復(fù)性或更大的臨床價(jià)值，可考慮對(duì)上述“*適條件”作適度的修改。

　　一、底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類(lèi)和濃度

　　這一項(xiàng)包括幾種因子，其中*重要的是底物種類(lèi)和濃度，這是每種測(cè)酶活性濃度方法中首先需要選擇的項(xiàng)目，選擇恰當(dāng)與否，對(duì)該酶測(cè)定至關(guān)重要。后面幾項(xiàng)則不是每種酶測(cè)定都會(huì)遇到的選擇。

　�。ㄒ唬┻x合適的底物種類(lèi)和濃度

　　如所測(cè)的酶專(zhuān)一性不強(qiáng)，可作用于多種底物，首先就需決定選擇哪一類(lèi)底物作為測(cè)此酶的底物。如該項(xiàng)酶測(cè)定主要用于臨床診療工作，則首先應(yīng)考慮選有較高診斷價(jià)值的底物。例如臨床上測(cè)定酸性磷酸酶主要用于診斷前列腺癌，所選的底物應(yīng)對(duì)前列腺酸性磷酸酶有較高的特異性。不易被其它組織如紅細(xì)胞、血小板中酸性磷酸酶所作用，在常用的底物中以麝香草酚磷酸鹽*符合上述選擇條件。但如進(jìn)行酶基礎(chǔ)研究，探討其在體內(nèi)作用時(shí)，則選擇酶在體內(nèi)的生理底物更為合適，一般而言在多種底物中，Km*小的底物往往是此酶的生理底物。

　　選擇Km小的底物測(cè)定酶還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，就是在反應(yīng)速度V的底物濃度也將。在實(shí)際工作中可能意味著試劑成本可能較低，不易出現(xiàn)底物難溶解的困難。

　　底物專(zhuān)一性強(qiáng)的酶雖然不面臨上述選擇，但只要所測(cè)酶催化的是可逆反應(yīng)，則和專(zhuān)一性不強(qiáng)酶一樣，都面臨著是選擇正向還是逆向反應(yīng)來(lái)測(cè)定酶，不同反應(yīng)方向的底物必然是不一樣的。這方面的選擇更多從技術(shù)和實(shí)用方面加以考慮往往選擇速度較快的方向，因?yàn)檫@可以提高測(cè)定的靈敏度，如測(cè)定肌酸激酶（CK），由于磷酸肌酸價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定，早期多選用正向反應(yīng)，底物為肌酸和ATP速度太慢，只是逆向反應(yīng)的1/6，測(cè)定靈敏度太低，以致正常標(biāo)本結(jié)果誤差很大。近年來(lái)都改用逆向反應(yīng)測(cè)定CK，明顯提高CK測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度。在此問(wèn)題上，實(shí)用考慮也起了不小作用。例如測(cè)定乳酸脫氫酶（LD）時(shí)，如考慮到正向反應(yīng)明顯快于逆向反應(yīng)，則應(yīng)考慮以丙酮酸和NADH為底物，這正是IFCC和其它一些學(xué)會(huì)推薦的方法。但目前市售的測(cè)LD的試劑盒不少都以乳酸和NAD＋為底物。因?yàn)镹AD＋價(jià)格明顯低于NADH，并且穩(wěn)定可長(zhǎng)期儲(chǔ)存�？蒲泄ぷ髦腥缧铚y(cè)LD，還是采用IFCC的方法。

　　確定底物種類(lèi)后，重要的問(wèn)題是選擇底物的合適濃度，在討論此問(wèn)題之前，有必要先簡(jiǎn)單復(fù)習(xí)一下底物濃度和酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系，因其不同于其它化學(xué)反應(yīng)有其獨(dú)特之處，圖17-2很形象表示出這種差異。

　反應(yīng)物濃度[S]
圖17-2a 反應(yīng)物濃度對(duì)化學(xué)反應(yīng)的影響

底物濃度[S]
圖17-2b　底物濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響

　　圖a表示在一般化學(xué)反應(yīng)中遵循質(zhì)量作用定律，反應(yīng)速度隨反應(yīng)物質(zhì)濃度增加成正比例增加，圖b則表示酶反應(yīng)中底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，酶反應(yīng)速度幾乎隨底物增加成正比例加快，進(jìn)一步升高底物濃度，雖然反應(yīng)速度也加快，但增加速度愈來(lái)愈慢，不成比例。到一定程度，反應(yīng)速度趨于恒定為一常數(shù)，實(shí)際上就是趨向反應(yīng)速度V，測(cè)定此處的反應(yīng)速度V，*能準(zhǔn)確地反映酶量多少。在此處底物濃度變化，對(duì)反應(yīng)速度影響很小。

　　Michaclis和Menten二式首先在本世紀(jì)初對(duì)酶反應(yīng)的此項(xiàng)獨(dú)特現(xiàn)象從理論上加以合理解釋。并推導(dǎo)出著名的米-門(mén)方程式：

　　此公式對(duì)選擇酶測(cè)定的底物濃度有重要的指導(dǎo)作用。Km對(duì)每一種酶而言在一定條件下為一常數(shù)，并可從上述方程式求出，在反應(yīng)速度為反應(yīng)速度V一半時(shí)，代入上式得：

　　Vkm＋V[S]＝2V[S]

　　VKm＝V[S]

　　[S]＝Km

　　換言之，當(dāng)酶促反應(yīng)速度為反應(yīng)速度一半時(shí)，此時(shí)的底物就相當(dāng)于酶的米氏常數(shù)Km。以mol/L表示之，大多數(shù)酶Km在10^-3至10^-5mol/L之間。

　　當(dāng)我們知道或計(jì)算出某一酶的Km后就可以計(jì)算出不同底物濃度和Km間的比值，化入米-門(mén)方程式就可計(jì)算出此時(shí)酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于反應(yīng)速度的百分比，見(jiàn)表：17-3

表17-3　底物濃度與Km比值相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)百分比

　　依據(jù)上表一般都認(rèn)為酶測(cè)定時(shí)底物濃度為Km的20倍乃至100倍。在實(shí)際工作考慮到底物溶解度的限制，價(jià)格的昂貴，可將底物濃度降為Km的10倍。再低就不適合酶的測(cè)定，可能產(chǎn)生較大誤差。

　　以上規(guī)律適用于大多數(shù)酶。一些酶還有其特殊情況，常能遇到的是當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǚ秶�后，酶反�?yīng)速度不僅不增加，反而下降。如乳酸脫氫酶，當(dāng)丙酮酸濃度超過(guò)一定量時(shí)，酶活性反而下降，故丙酮酸濃度不能過(guò)高。

　　以上介紹的米-門(mén)方程式只適用于單一底物的酶，不少酶催化反應(yīng)二底物乃至更多底物，有關(guān)二底物的米-門(mén)方程以及此時(shí)底物濃度的選擇可參考一些有關(guān)書(shū)籍。實(shí)際工作中*簡(jiǎn)單的作法是先將其中底物的濃度選得很高，使酶飽和，然后求出另一底物的表觀(guān)Km，反之亦然，*后按上述規(guī)律決定二底物的合適濃度。

　�。ǘ�）輔因子、活化劑的種類(lèi)和濃度

　　從廣義上說(shuō)，凡能促進(jìn)酶及反應(yīng)物進(jìn)入活化狀態(tài)從而加速酶催化反應(yīng)的物質(zhì)都能稱(chēng)為輔因子，它包括種類(lèi)很廣的物質(zhì)。英漢生化詞典將輔因子（cofactors）定義為“一種酶的活性所需要的一種非蛋白質(zhì)成分”。這種輔因子可能是一種金屬離子激活劑或一種有機(jī)分子（輔酶）。它們或松或緊地與酶相結(jié)合；緊密接合的輔因子稱(chēng)為“輔基”。將激活劑（activator）定義為“一種金屬離子，作為一種酶的輔助因子。”

　　在前面已談到，測(cè)酶活性濃度時(shí)應(yīng)該在*適條件下測(cè)酶反應(yīng)的速度。如測(cè)定酶需要輔因子，活化劑時(shí)，應(yīng)選擇合適的種類(lèi)和濃度加入到測(cè)定酶的體系中，在些過(guò)程中可能會(huì)涉及到下列四類(lèi)物質(zhì)。

　　首先是輔酶（Coenzyme）。很多酶反應(yīng)都必須有輔酶參加。如相當(dāng)部分的還原酶需要輔酶Ⅰ（NAD＋）和輔酶Ⅱ（NADD＋）參加。ATP是激酶（Kinase）反應(yīng)中不可少的輔酶，這類(lèi)物質(zhì)一般是小的有機(jī)化合物，和輔基不同點(diǎn)是與酶蛋白結(jié)合很松弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開(kāi)，盡管它們不用于酶的底物，特異性不強(qiáng)，往往參加一系列酶反應(yīng)和代謝過(guò)程。但在作用方式上和底物類(lèi)似，在酶反應(yīng)過(guò)程中與酶結(jié)合、分離及反復(fù)循環(huán)。在方法學(xué)上，可將它們按底物處理，即可按米-門(mén)方程式求出其Km，按底物規(guī)律選擇其濃度。

　　第二是輔基，輔基雖也是小的有機(jī)化合物，但卻是酶蛋白不可分割部分，不含輔基的酶蛋白稱(chēng)為脫輔基酶蛋白（apoenzyme），沒(méi)有催化活性，必須加入足量輔基，和它結(jié)合成為全酶（holoenzyme），才可能有催化活性。*典型的例子是各種轉(zhuǎn)氨酶需要磷酸吡哆醛為其輔基，在反應(yīng)過(guò)程中。氨基酸將其氨基交給吡哆醛變?yōu)檫炼甙�，本身接受醛基成為酮酸，然后吡哆胺將氨基轉(zhuǎn)交給酮酸生成氨基酸，本身又變回吡哆醛。從此機(jī)制不難理解為何脫輔基酶蛋白無(wú)催化活性。

　　輔基和輔酶不同點(diǎn)不僅表現(xiàn)在和酶蛋白結(jié)合緊密，不易為透析所除去，和酶作用方式也不同，不似輔酶迅速與酶結(jié)合，又迅速分解為酶和產(chǎn)物，輔基顯著特點(diǎn)是與酶結(jié)合需要一定時(shí)間，因此在酶測(cè)定時(shí)，如按底物一樣來(lái)處理輔基，在酶反應(yīng)開(kāi)始時(shí)才加入輔基，則開(kāi)始階段反應(yīng)較慢，經(jīng)過(guò)一段延滯期后，反應(yīng)才達(dá)到應(yīng)有速度。因此在酶測(cè)定時(shí)，往往是先加入足量輔基，作用一定時(shí)間如10分鐘后，再加入底物開(kāi)始酶反應(yīng)。

　　很多輔酶和輔基來(lái)自維生素或結(jié)構(gòu)中含有維生素，如NAD和NADP來(lái)自維生素尼克酸，轉(zhuǎn)氨酶的輔基磷酸吡哆醛來(lái)自維生素B₆（吡哆醇）。來(lái)自維生素B₁的焦磷酸硫胺素是丙酮酸脫羧反應(yīng)的輔羧化酶。從維生素B₂（核黃素）形成的FAD，F(xiàn)MN是很多呼吸鏈上酶的輔基，維生素H（生物素）在羧化和脫羧作用中起輔基作用，葉酸衍生物參與一碳基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。維生素B₁₂的衍生物鈷胺酰胺參與酶催化的異構(gòu)反應(yīng)。

　　第三類(lèi)物質(zhì)是離子，很多酶需要特定離子幫助才能使其反應(yīng)達(dá)到速度。*常見(jiàn)的是二價(jià)金屬離子如Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺等。所有轉(zhuǎn)移磷酸的酶，如激酶類(lèi)和堿性磷酸酶的反應(yīng)都需要Mg²⁺的參加。所以如在反應(yīng)體系中加入金屬螯合劑如ED-TA或以他們?yōu)榭鼓齽┏Ｒ种埔恍┟傅幕钚�。因此酶測(cè)定的標(biāo)本多采用血清而不采用血漿，以外還有單價(jià)的K⁺。如丙酮酸激酶反應(yīng)同時(shí)需要K⁺和Mg²⁺。淀粉酶催化的反應(yīng)需要陰離子Cl^-，5mmol/L氯離子可加速淀粉酶的反應(yīng)三倍。

　　離子加速酶反應(yīng)的機(jī)制是多種多樣，Zn²⁺是堿性磷酸酶和羧基肽酶A整體結(jié)構(gòu)的一部分，可穩(wěn)定酶的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。Cl^-加速淀粉酶反應(yīng)的機(jī)制可能與它能與酶分子中某些帶陽(yáng)電荷基團(tuán)結(jié)合有關(guān)，改變了在催化作用中起重要作用的基團(tuán)的電離常數(shù)，有些離子可使酶分子帶陽(yáng)電荷，和帶陰性電荷的底物結(jié)合，在酶反應(yīng)中起了橋梁作用。必須注意的是，過(guò)量的離子往往抑制酶反應(yīng)速度，在測(cè)定酶時(shí)要選擇合適的濃度。

　　第四類(lèi)是一些無(wú)法包括在前三類(lèi)的其它加速酶反應(yīng)物質(zhì)，如巰基化合物可穩(wěn)定酶的雙硫鍵。在肌酸激酶反應(yīng)體系中加入它將明顯增高酶活性，并且隨所加巰基化合物的不同，增加的速度也有差異，所以在測(cè)肌酸激酶時(shí)要選擇好巰基化合物的種類(lèi)與合適的濃度。

　　還有所謂的表觀(guān)激活作用，該物質(zhì)并不是真正加快反應(yīng)速度，而是由于和抑制劑作用抵消了抑制作用，從表面上看似乎是加速了酶的反應(yīng)作用。

　�。ㄈ�）選變構(gòu)劑的種類(lèi)與濃度

　　有一類(lèi)特殊的酶叫變構(gòu)酶（allosteric enzyme），其反應(yīng)速度和底物關(guān)系不同于一般酶的雙曲線(xiàn)，而出現(xiàn)S形曲線(xiàn)，這是由于這種酶具有二個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特的部位－或是相互作用的催化部位，或是相互作用的催化部位與調(diào)節(jié)部位，其結(jié)果是酶與底物作用速度將受另一類(lèi)物質(zhì)的影響，這類(lèi)物質(zhì)命名為變構(gòu)劑或效應(yīng)物。根據(jù)作用不同又分為變構(gòu)激活劑和變構(gòu)抑制劑或者正負(fù)效應(yīng)物，而不同濃度的變構(gòu)劑會(huì)明顯改變曲線(xiàn)形狀。變構(gòu)酶在物質(zhì)代謝中有重要的調(diào)節(jié)作用。在測(cè)定變構(gòu)酶活性濃度時(shí)，必須選擇好變構(gòu)劑種類(lèi)和濃度。一般來(lái)說(shuō)應(yīng)選擇在飽和濃度的變構(gòu)劑的條件下測(cè)定構(gòu)酶的活性濃度。

　　二、指示酶與輔助酶的種類(lèi)和濃度

　　采用酶偶聯(lián)法測(cè)定酶活性濃度時(shí)，反應(yīng)體系必須加入指示酶，有些方法還加用輔助酶，在選擇或設(shè)計(jì)此類(lèi)方法時(shí)，必須考慮合適的酶和濃度，有關(guān)問(wèn)題將在后面“連續(xù)監(jiān)測(cè)法酶活性濃度”一節(jié)中詳加討論。

　　三、反應(yīng)體系的*適pH、緩沖液的種類(lèi)和濃度

　　固定酶反應(yīng)的其它條件，在不同pH處測(cè)定酶反應(yīng)速度，可得各種類(lèi)型的酶活性與pH關(guān)系見(jiàn)圖17-3A。

圖17-3A　酶活性與pH的函數(shù)關(guān)系曲線(xiàn)可能具有的幾種形狀

　　*常見(jiàn)的是（a）的對(duì)稱(chēng)鐘形曲線(xiàn)，少數(shù)的如（b）（c）在一側(cè)即偏酸或偏堿處活性。生化學(xué)家將酶活性處的pH稱(chēng)為*適pH。一般來(lái)說(shuō)，血清中大多數(shù)酶*適pH接近中性（pH6.5-7.5）。有些酶在*適pH處活性變化尖銳明顯，也有些平坦寬廣。測(cè)定酶活性濃度時(shí)一定要選擇在*適pH處，不僅因?yàn)榇颂幟阜磻?yīng)速度，測(cè)定靈敏度，還因?yàn)榇颂幟富钚宰兓�的斜�?小，如反應(yīng)體系中出現(xiàn)pH變化時(shí)，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響*小。

圖17-3B　pH對(duì)酶活性及穩(wěn)定性的作用

　　曲線(xiàn)A：V對(duì)pH作圖曲線(xiàn)B：酶先在pH5及pH8預(yù)孵育后，在pH6.8測(cè)活性

　　氫離子可以通過(guò)多種途徑影響酶催化反應(yīng)。如在脫氫酶反應(yīng)中往往需要?dú)潆x子參加，也可能產(chǎn)生氫離子，從理論上可以將氫離子看成是該反應(yīng)的底物和產(chǎn)物。此外，當(dāng)pH變化時(shí)，可影響到底物、酶、酶-底物復(fù)合物的解離狀態(tài)和構(gòu)型，甚至還可能影響到各種輔因子，從而影響酶活性。

　　PH對(duì)酶還有一個(gè)重要的作用，就是影響酶的穩(wěn)定性。圖17-3B介紹一個(gè)有關(guān)實(shí)驗(yàn)。

　　圖中曲線(xiàn)A是*適pH實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，出現(xiàn)典型的鐘形曲線(xiàn)，其*適pH為6.8，高于或低于6.8時(shí)，酶反應(yīng)速度下降，下降原因可能與上述諸因素有關(guān)，但也可能由于酶穩(wěn)定性下降失活所致，或者是二類(lèi)原因之總和。通過(guò)曲線(xiàn)B的實(shí)驗(yàn)，可將上述二類(lèi)原因分清。此時(shí)先將酶與不同pH底物緩沖液溫育一段時(shí)間，此時(shí)間一般與測(cè)定時(shí)間相當(dāng)，然后再將pH調(diào)回*適pH處測(cè)其活性。從曲線(xiàn)B可以說(shuō)在pH5-6.8以及pH6.8-8.0之間酶活性的下降與酶滅活關(guān)系不大，酶在*適pH處儲(chǔ)存常數(shù)穩(wěn)定。但有些酶貯存在*適pH時(shí)，并不一定比在其它pH處更穩(wěn)定。

　　*適pH并非是酶的特征性常數(shù)，易受多種因素影響而改變，如緩沖液的種類(lèi)、底物濃度、溫度等，在研究pH對(duì)酶穩(wěn)定性影響還應(yīng)注意到酶濃度高低，在低濃度時(shí)，酶易解離為單體，常比多聚體更易滅活。還應(yīng)注意試劑中各種防腐劑和其它添加劑的影響。

　　*后必須強(qiáng)調(diào)的是本節(jié)討論的pH并不是指底物緩沖液的pH，而是底物和標(biāo)本混合后的pH對(duì)反應(yīng)速度的影響，由于實(shí)驗(yàn)室所測(cè)的標(biāo)本很少是純酶樣品，多為體液或組織粗提液。它們也是有一定pH值和緩沖能力的緩沖液，和底物緩沖液混后后，不一定維持住原來(lái)pH，特別是當(dāng)二溶液的pH相差甚遠(yuǎn)時(shí)，變化更大。例如堿性磷酸酶*適pH為10.2，雖然底物pH也是10.2，但血清標(biāo)本pH為中性，混合液的pH必然低于10.2，降低程度取決于血清的pH和緩沖能力。從而影響酶測(cè)定結(jié)果，臨床觀(guān)察證實(shí)：當(dāng)血清標(biāo)本放置過(guò)夜后用金氏法再測(cè)堿性磷酸酶時(shí)，結(jié)果常升高。有人認(rèn)為這與血清放置過(guò)長(zhǎng)，由于CO₂逸出引起血清pH偏堿有關(guān)。

　　在下列情況極易引起混合液pH偏離底物緩沖液的pH：一是標(biāo)本用量太大，如以前有些方法，為節(jié)省底物，底物緩沖液用量和血清用量相等，此時(shí)混合液pH可能在此二液pH之間，有可能引起較大測(cè)定誤差。所以在文件中規(guī)定“標(biāo)本在總體積中的比例應(yīng)在10％以下”。就是要盡量減少標(biāo)本中各種物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。二是底物緩沖液緩沖能力太低。如金氏法測(cè)堿性磷酸酶時(shí)使用的碳酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L，濃度這樣低的緩沖液，必定要受標(biāo)本pH的影響。

　　過(guò)去長(zhǎng)期以來(lái)，認(rèn)為緩沖液作用就是維持酶反應(yīng)的*適pH，忽視了緩沖物質(zhì)對(duì)酶反應(yīng)的其它作用和影響，Howell等研究了酶活性在三種不同緩沖液的變化情況見(jiàn)圖17-4。

圖17-4　各種緩沖液的溫度及pH的關(guān)系
TRIS：三羥甲基氨基甲烷0.1mol/L
TRA：三乙醇胺0.1mol/L

　　三種不同緩沖液不僅*適pH不一樣，反應(yīng)速度也有差異，從測(cè)定酶活性濃度角度，應(yīng)該選用枸櫞酸緩沖液，類(lèi)似現(xiàn)象在大多數(shù)酶都能觀(guān)察到，僅是程度不同，其中以堿性磷酸酶活性受到緩沖液種類(lèi)影響*為顯著，在二乙醇胺緩沖液所測(cè)酶活性約比在碳酸鹽緩沖液所測(cè)的高2倍。

　　由于緩沖液含有大量離子，或影響酶蛋白的構(gòu)型，或影響底物的解離程度等等，從而影響酶活性。Allert曾擬定了一種作用模式，并進(jìn)行數(shù)學(xué)計(jì)算，得出相應(yīng)方程式來(lái)說(shuō)明反應(yīng)體系中電解質(zhì)會(huì)影響反應(yīng)速度V，且不同濃度電解質(zhì)的影響有差異。因此在方法設(shè)計(jì)時(shí)，選完緩沖物質(zhì)后，還必須了解不同濃度緩沖液對(duì)酶活性的影響。一般而言，隨緩沖液濃度增加，電解質(zhì)干擾酶和底物結(jié)合，酶活性將逐步下降，所以選擇緩沖液濃度時(shí)，常需在濃度較高以保持足夠緩沖能力和濃度較低以免抑制酶活性?xún)蓚�(gè)相矛盾作用之間取得平衡。

　　在目前酶測(cè)定常用的一大類(lèi)所謂生物緩沖物質(zhì)，如圖中的Tris、三乙醇胺受溫度影響較大。因此在我國(guó)學(xué)會(huì)文件中指出“配制緩沖液時(shí)不僅要指出其pH值，還應(yīng)說(shuō)明配制溫度，以避免因溫度不同而引起的誤差。”在此圖中還可看到，即使是同一種緩沖液，隨其它物質(zhì)存在，也有可能改變溫度的影響。因此在實(shí)際配制緩沖液時(shí)，應(yīng)首先將配制溶液溫度調(diào)節(jié)到規(guī)定溫度，然后在pH計(jì)監(jiān)測(cè)下加入相應(yīng)的酸或堿將溶液pH調(diào)到要求范圍。不控制溫度，不用pH計(jì)盲目按一些書(shū)提供的量配制緩沖液是不可取的。

　　四、其它影響酶活性因素

　　除了上述主要因素外，一些其它因素也會(huì)影響酶活性，如反應(yīng)體系中含有氧化劑，可氧化酶蛋白中甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸殘基，使酶失活，試劑盒中常用的一些表面活性劑如Tween-80、Brig-35等會(huì)抑制一些酶的活性。

　　其它因素中，對(duì)酶測(cè)定而言，*重要的是抑制劑的作用，抑制作用是酶學(xué)中的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容。但如只涉及到設(shè)計(jì)和選擇測(cè)定酶的方法，則比較簡(jiǎn)單，既然要測(cè)定的是“*適條件”下的反應(yīng)速度，那么不論是可逆或不可逆抑制劑，也不論是競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑都應(yīng)在反應(yīng)體系中設(shè)法除去。此問(wèn)題在測(cè)定尿液中尤為突出。尿中排出大量代謝產(chǎn)物，不少物質(zhì)會(huì)影響酶，如脲可使酶解聚、磷酸鹽抑制磷酸酶活性。在病理情況下尤其使用各種藥物后，使情況更為復(fù)雜，此時(shí)尿中可出現(xiàn)不少正常情況下不出現(xiàn)物質(zhì)，即可能抑制酶活性，也可能激活酶活性。為使脲酶測(cè)定結(jié)果有一定可比性，在測(cè)定脲酶前，通過(guò)透析、凝膠層析或超濾將小分子化合物與酶分開(kāi)，這樣較為可靠。

　　五、溫度的控制

　　要了解此問(wèn)題，應(yīng)注意溫度對(duì)酶活性影響的雙重性。首先，化學(xué)速度隨溫度升高而加快，酶反應(yīng)也不例外。Q₁₀值即溫度增加10℃，化學(xué)速度的變化率。酶的Q₁₀值約在1.5-2.5之間。

　　溫度與反應(yīng)速度之間關(guān)系，可用Arrhenius方程式來(lái)表示：

　　Logk＝－E/2.303RT+常數(shù)

　　式中k是反應(yīng)常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，R為氣體常數(shù)。E為活化能也是常數(shù)。在酶反應(yīng)中V＝K·[E]。所以在酶反應(yīng)中，LogV和1/T作圖為一直線(xiàn)，斜率為－E/2.303R。通過(guò)每一直線(xiàn)斜率不難計(jì)算出該酶反應(yīng)的活化能E。

　　但是，測(cè)定酶時(shí)都需要酶和底物在一定溫度下作用一段時(shí)間，在此期間，溫度有可能使酶失活，不同酶在此方面差異很大，有些酶如胎盤(pán)堿性磷酸酶在56℃放置15分鐘，活性也不下降，有些酶如酸性磷酸酶，37℃1小時(shí)后，失去50％酶活性。酶的穩(wěn)定性還與其它因素，如作用時(shí)間、pH、有無(wú)底物、有無(wú)其它蛋白等有關(guān)。同為堿性磷酸酶，在肝提取液中遠(yuǎn)不如血清中穩(wěn)定，37℃作用15分鐘后肝中此酶活性將顯著下降。又如將血清pH降低在pH6.0以下，血清中酸性磷酸酶將長(zhǎng)期穩(wěn)定。

圖17-5　預(yù)溫15分（37℃，pH9.9）對(duì)ALP活性的影響
○與●表示肝ALP活性不預(yù)溫和預(yù)溫的變化
△與▲表示血清ALP活性不預(yù)溫和預(yù)溫的變化

圖17-5形象說(shuō)明預(yù)溫過(guò)程對(duì)酶活性的影響。

　　目前常規(guī)工作實(shí)驗(yàn)室越來(lái)越多的使用37℃，一些國(guó)家已明確推薦使用此溫度。這更多地是從實(shí)際工作方便來(lái)考慮。因?yàn)闇囟壬�高，反�?yīng)速度快，靈敏度高。同時(shí)延滯時(shí)間和測(cè)定時(shí)間都可能縮短。從而有利于提高工作效率。尤其目前在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用全自動(dòng)生化分析儀，有高效率的恒溫系統(tǒng)，使反應(yīng)系統(tǒng)很快升溫并維持在37℃，可避免溫度差異引起的誤差。但在37℃時(shí)，不可避免地一些酶可能失活。

　　早期曾推薦使用25℃為酶測(cè)定溫度，其優(yōu)點(diǎn)為接近室溫，反應(yīng)體系溫度很容易平衡到此溫度，這對(duì)于當(dāng)時(shí)使用無(wú)有效控溫系統(tǒng)的分光光度計(jì)來(lái)測(cè)酶活化性有其特別方便之處。但溫度低。反應(yīng)太慢。在有些溫?zé)岬貐^(qū)，當(dāng)室溫超過(guò)25℃時(shí)，還需使用降溫系統(tǒng)很不方便。因此目前已很少有實(shí)驗(yàn)室采用此溫度。

　　IFCC推薦的30℃，兼顧了上述二溫度的優(yōu)點(diǎn)，即保證了一定的反應(yīng)速度。又無(wú)酶失活之?dāng)_，此外還有一個(gè)上述二溫度沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，即可以鎵作為此溫度的基準(zhǔn)物質(zhì)，純鎵的熔點(diǎn)為29.77℃。保證了測(cè)定系統(tǒng)計(jì)30℃的高度準(zhǔn)確性，而37℃和25℃至今尚無(wú)一個(gè)*準(zhǔn)確的確定方法。

　　30℃和37℃是目前使用*廣泛的二種測(cè)定酶的使用的溫度。在比較不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果時(shí)，一定要注意由此引起來(lái)的差異，否則將導(dǎo)致臨床診斷的困難和誤差。一些作者提出使用二溫度間的轉(zhuǎn)換系數(shù)使二溫度測(cè)定結(jié)果的比較變?yōu)榭杀�。雖然一些作者持懷疑態(tài)度，用一個(gè)系數(shù)能代表所有標(biāo)本中的變化情況嗎？*新研究證實(shí)只要所用方法合適，人類(lèi)血清中酶對(duì)溫度變化的反應(yīng)差異不大，在無(wú)法統(tǒng)一溫度情況下，這還不失為一權(quán)宜之計(jì)，常用酶的溫度轉(zhuǎn)換系數(shù)可參見(jiàn)表17-4：

表17-4　常見(jiàn)酶溫度轉(zhuǎn)化系數(shù)

　　不論選用何種溫度測(cè)酶，由于酶反應(yīng)受溫度影響很大，在測(cè)定時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)體系的溫度變化應(yīng)控制在±0.1℃內(nèi)。應(yīng)用國(guó)產(chǎn)普通恒溫水浴箱來(lái)測(cè)酶活性是不合適的，應(yīng)使用帶有攪拌器的高級(jí)恒溫水浴。