HePG2細胞屬人肝腫瘤的恒生細胞株，L-02細胞則是人胎肝細胞株，二者所使用的培養(yǎng)基可以是一樣的，即*常見的DMEM。一般使用低糖的。
  細胞長滿培養(yǎng)瓶時既要傳代。使用胰酶消化即可。用D-Hank＇s液或PBS配制成0.25%的胰酶。使用前37度預(yù)熱，細胞經(jīng)PBS清洗兩遍后，每個中號培養(yǎng)瓶加 0.7ml的胰酶，胰酶的量可根據(jù)自己培養(yǎng)瓶的大小而定，原則就是能夠蓋滿瓶底。加入胰酶以后，為使酶的活性，將培養(yǎng)瓶蓋擰緊后放回培養(yǎng)箱中，3分鐘 左右即用含血清的培養(yǎng)基終止消化。如果在室溫情況下消化，時間相應(yīng)加長，可以在顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞界限已十分清楚，即已分離為單個細胞，且有少量細胞漂 起，則要終止消化了。

HepG2細胞株的傳代經(jīng)驗：
  首先在倒置顯微鏡下觀察生長融合達 80%，不需要長滿，就準(zhǔn)備傳代。倒掉舊的培養(yǎng)基，再用已經(jīng)高壓滅菌過的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培養(yǎng)瓶，加入1毫升已經(jīng)配制好的 0.25%胰蛋白酶－0.02EDTA（0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用濾紙過濾，再用一次性過濾器過濾除菌，再分裝成1ml的小包裝，剛好 每次用完一個，避免每次反復(fù)凍存，會使胰酶的活性下降），加入的量以剛好蓋滿瓶底為宜。放到倒置顯微鏡下觀察變化，一旦發(fā)現(xiàn)細胞開始變圓收縮，大約1－3 分鐘時間，必要時可以吹打幫助細胞分散，就立即加入培養(yǎng)基中和胰酶，如有EDTA要離心（800rpm,5min），棄上清夜，再加入完全培養(yǎng)基吹 勻，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培養(yǎng)箱，37度培養(yǎng)24小時后觀察。

鏡下觀察細胞生長融合達70-80%，準(zhǔn)備傳代。常規(guī)開紫外照射超凈臺30分鐘，同時把含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、PBS放置37 度培養(yǎng)箱中孵育。20分鐘后開始傳代。先棄掉舊培養(yǎng)液，加PBS洗一次，然后加0.25%胰酶2ml消化（指10乘10cm大小的培養(yǎng)瓶）細胞，鏡下觀察細胞，細胞突起回縮，細胞變圓，然后將培養(yǎng)瓶放置37度二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3分鐘左右（當(dāng)然時間是隨機的，比如：新配的胰酶作用時間短一些，配制時間長 的胰酶作用時間會長一些，當(dāng)然要不斷地鏡下觀察），待細胞大部分消化下來（大部分細胞呈流沙狀脫離瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基終止消 化。反復(fù)吹打瓶壁上殘留的細胞，并將已消化下來的細胞吹打均勻，然后吸入離心管中1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，然后棄掉上清，用手指將離心管中的細胞彈打均勻， 加新培養(yǎng)基，吹打均勻，分至3個新的培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶平放，小心移入37度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日觀察。

胰酶放入37度水浴箱中,千萬記住不要蓋上水浴箱的蓋子.傳代時,我一般把培養(yǎng)瓶口過一下火,就直接把培養(yǎng)液到去,再 用0.25%的胰酶（不含EDTA）消化.等細胞變圓,細胞間空隙加大就直接把培養(yǎng)液到去,不用離心,然后再吹打,雖說要輕柔,但很難吹打成單細胞懸液, 所以稍用力也沒有關(guān)系.雖然操作不規(guī)范,但節(jié)省時間,細胞也沒有被污染.

AAV-293細胞較喜歡成團生長,比較嬌嫩,怕冷,傳代時不要一次從二氧化碳培養(yǎng)箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出來傳就可以了,否則細胞很容易死掉.細胞在50-60%傳代,細胞生長狀態(tài).
  用 D-Hank＇s液配制成0.25%的胰酶消化半分鐘左右,棄去胰酶.觀察培養(yǎng)瓶是否有針孔樣縫隙,如有就可以加入培養(yǎng)液吹打細胞.消化過久,對細胞損害 很大,而且成團很難吹打成單個細胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.輕輕放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

其中絕大部分都是貼壁細胞，具體如：
  （1） A549（肺腺癌）（2）　NCI-H446（小肺細胞癌）（3）　801（非小肺細胞癌）（4）　NCI-H460�。ù蠹毎�肺癌）
  在消化傳代過程中，步驟基本一致：
  吸 去舊的培養(yǎng)液－＞用Hank’s（1×）清洗一兩次－＞加入一定量的消化液（Trpsin-EDTA）－＞置顯微鏡下觀察，待細胞大部分變圓時，回到超凈臺－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細胞全部懸浮起來－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞*后再補充加 入一定量新的培養(yǎng)液（RPMI1640 with10 %　FBS）．
  注意：　吹細胞時盡量多吹邊角兒，此處細胞生長的多．另外吸出細胞前要混勻．
  另注：消化液的配制方法：
  Trpsin-EDTA（1X）－－0.25% Trpsin with EDTA-4Na
  prepared with 2.5g  Trpsin（1:250） ａnd 0.38g  EDTA-4Na/L in HBSS.

吸棄原培養(yǎng)液－－>PBS洗一兩次－－>加入400ul0.125％胰酶（原代加0.05% EDTA）消化－－>轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，保證整個盤面都被trypsin液潤過->吸棄trypsin后37度消化3min－－>以完全培液 （DMEM  10% FCS＋1/1000Biotin 1/1000泛酸鈣－－>吸打（盡量輕緩），1：4-10接種，前后左右搖晃培養(yǎng)皿，細胞均勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（10%CO2 ,37度）

類型：貼壁細胞
  傳代步驟：
  棄去舊的生長液－－>用無鈣鎂水（CMF）沖洗貼壁細胞數(shù)次（視細胞瓶的大小,3－－5次）－－>剩少許CMF,滴入 ATV 2－－3滴－－>搖勻細胞瓶中的液體,使ATV均勻的分布到瓶里的沒個地方－－>放入37度二氧化碳溫箱中3－－5min消化－－>棄 去ATV,加入生長液,拍打吸吹下細胞－－>鏡下觀察－－>分瓶－－>作好記號,放入37度二氧化碳溫箱生長
  細胞特點:該細胞生長力強,而且快速一般24h就可以張到80%,48h不傳就會變的很老,所以該細胞傳時要勤點;我感覺MDBK還是很好傳的,比以前我傳的ST、 Vero細胞等要好傳一些，且不那么容易死亡，所以是我的一個比較好的選擇！該細胞適合接種皰疹病毒（如：偽狂犬病毒）！

棄除舊的培養(yǎng)液后－－-用緩沖液沖洗一遍－－－－用0.22%的胰酶消化液消化約兩分鐘左右可以看到細胞像沙子一樣脫落－－－－－－-趕緊倒掉胰酶加入含 10%的牛血清培養(yǎng)液終止消化。但目前國內(nèi)能找到的BHK-21細胞大部分都有支原體感染，如果是好的BHK-21細胞能做到1比20的分種率。
  補充一點關(guān)于BHK-21的培養(yǎng),先用少量胰酶沖洗一下,棄去,再用胰酶消化1min左右,效果會好一些

BHK－21的經(jīng)驗：
  吸出培養(yǎng)基，吸得越干凈越好，緩沖液洗滌2-3遍，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培養(yǎng)箱消化。如果細胞長得太老，可以先加入1ml胰酶在細胞 表面浸潤一下就吸出來，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前預(yù)熱到37度。由于胰酶平時保存在4度，反復(fù)預(yù)熱對胰酶的活性不好，我的經(jīng)驗是將胰酶 進行分裝，盡可能避免胰酶反復(fù)冷卻加熱。消化時間的選擇要根據(jù)實際情況決定，BHK－21還是比較好消化的，3－8min應(yīng)該足夠了，消化時間太長對細胞不利�？梢栽陲@微鏡下觀察消化情況，必要時可以拍打培養(yǎng)瓶幫助細胞分散，消化結(jié)束后直接加入培養(yǎng)基即可，胰酶會被血清滅活。一般在T－25瓶中留 7－8ml培養(yǎng)基培養(yǎng)。在90％單層細胞時，1：4傳代2天后可長滿。如果使用的培養(yǎng)基偏堿先放在CO2培養(yǎng)箱中平衡。細胞生長中注意觀察培養(yǎng)基顏色 （加入酚紅作指示劑），如出現(xiàn)偏黃表明細胞代謝產(chǎn)酸較多，此時如細胞未長滿應(yīng)更換部分或全部培養(yǎng)基以確保細胞狀態(tài)不受影響。

細胞：皮膚成纖維細胞是貼壁生長的。THP-1細胞是懸浮的。
  由于我們實驗室養(yǎng)細胞的時間也不是很長，所以也只能說說自己平時的操作了。
  先說皮膚成纖維細胞。當(dāng)細胞鋪滿瓶底，也就是細胞與細胞之間沒有間隙時，就可以傳代了。一般十天左右傳一代。先吸棄舊培養(yǎng)液，用D-Hanks液洗兩遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆蓋瓶底為準(zhǔn)。加入后輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使液體覆蓋瓶底，然后靜置兩分鐘左右，是能在顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞之間出現(xiàn)間 隙且有一部分細胞呈現(xiàn)圓形后即可。吸去胰酶，加入含血清培養(yǎng)液，搖晃瓶子使培養(yǎng)液覆蓋瓶底就行了。因為血清可以終止胰酶的消化。然后吹打瓶底各處使細胞脫 落。再分瓶補加培養(yǎng)液。
  THP-1細胞的傳代就比較簡單了�？梢杂袃煞N傳代方法。如果鏡下觀察細胞狀態(tài)很好，沒有其它雜質(zhì)即細胞裂解物之類的，就 可以采用直接傳代法。傳代前將細胞培養(yǎng)瓶直立一個半小時使細胞自然下沉。吸棄上層少量培養(yǎng)液約三分，將余下的培養(yǎng)液分成兩瓶，再分別補加培養(yǎng)液即可。 如果鏡下觀察覺得培養(yǎng)液中有雜質(zhì)即可采用離心傳代法。如果細胞數(shù)目較多可以低速離心約600轉(zhuǎn)離心六分鐘，細胞可以沉淀下來而且可以去除細胞碎片之類的雜 質(zhì)。如果覺得細胞數(shù)目不多比較寶貴，那就提高轉(zhuǎn)速可以1000轉(zhuǎn)離心六分鐘，這樣細胞損失很少但可能也有些雜質(zhì)會一起沉淀下來。離心后去除上清液，加入新 的培養(yǎng)液吹打渾勻即可分瓶傳代了。
  目前的方法就這些，希望對新手有所幫助

我養(yǎng)的細胞都是乳腺癌細胞，就是以下幾種，
  1、 MCF-7：是一種很好養(yǎng)的人乳腺癌細胞，培養(yǎng)基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能長得很好。一般兩到三天傳一代。傳代也很常規(guī)。吸出培養(yǎng)基，加入0.25％的胰酶1ml，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使胰酶流遍瓶壁，以 去除殘余的培養(yǎng)基。再加入2ml胰酶（25ml培養(yǎng)瓶）靜置消化2－5min，待細胞縮起變圓，將胰酶吸出加入培養(yǎng)基3ml吹打成單細胞懸液分瓶即可。我 一般都不用緩沖液沖洗，而直接用胰酶沖洗一下以去除剩余血清的作用，感覺效果還不錯。因為MCF-7消化較快，一般不放到培養(yǎng)箱中消化，以免消化太過。需 要注意的是MCF-7生長較快如不及時傳代可出現(xiàn)整瓶細胞浮起，一般都來不及搶救。
  
  2、T47D：也是一種人乳腺癌細胞，培養(yǎng)基用DMEM＋10－15％的小牛血清，培養(yǎng)方法與MCF-7差不多，但這種細胞傳代時間長了會極難養(yǎng)。我曾養(yǎng)過一株新從美國購置的，兩三天傳一代，長得很旺。后又從國內(nèi)購買一株時間較長的，要七天傳一代，而且很嬌氣。
  
  3、MA891 鼠乳腺癌細胞：這種細胞比較特殊的是很難消化，容易消化成一團一團的，如果胰酶的量比常用的多三分充分預(yù)熱并放入培養(yǎng)箱中消化就會好的多。傳到15－20代細胞就易長成團，從此生長緩慢，形態(tài)改變，需要復(fù)蘇重養(yǎng)。

首先要把0.25%的胰酶和培養(yǎng)液在37度水浴20~30分鐘（預(yù)熱）.從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)的細胞瓶（一般我是讓它長到90%幾再傳代的）,吸去培養(yǎng)液, 可用PBS洗兩遍.也可不洗.加入適量0.25%胰酶消化（試瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了）,讓它都浸濕細胞就可以吸去了.等個三 十秒就在手上拍打,不要太用勁.就可以看到細胞脫落了,再加入3毫升左右的培養(yǎng)液吹打（這時加的培養(yǎng)液不要太多,否則難吹打成單個細胞!）,制成細胞懸 液,再傳至消毒的培養(yǎng)瓶中（我一般是1傳三,三天后又可以傳代了）再加入適量培養(yǎng)液（如250毫升瓶中加入12~14毫升）.再放置在37度5%CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng).
  在操作過程中要有酒精燈的,瓶口,鑷子等可在火上過一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.無菌觀念要強!

80%-90%confluency, 吸棄原培養(yǎng)液－－>PBS洗一次－－>加入400ul0.125％胰酶（10cm）－－>轉(zhuǎn)動培養(yǎng)盤，保證整個盤面都被trypsin 液潤過->37度消化5-10min－－>以完全培液（RPMI1640 10% FBS－－>吸打,1：5接種，前后左右搖晃培養(yǎng)盤，細胞均勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)（5%CO2 ,37度，24h一個周期

是一種貼壁細胞，貼壁后繁殖迅速，約3－4天傳代。切記：不要等到細胞貼的太滿，約70－80％即可傳代（細胞傳代時不能長的太滿,70%-80%就可以 傳了BSZLY2003）。否則細胞容易聚團，再想將其打散很不容易，并且打散后細胞的狀態(tài)也不好了。我用的消化液是EDTA，新配的感覺特好用，胰酶也 用過，但不如EDTA好用。以下傳代方法同樓上各位朋友。
  另外還有一點建議：細胞傳代之前用75％酒精棉球擦一擦手。細胞培養(yǎng)瓶打開前也要擦一下，可以降低污染的幾率。

是小鼠骨髓瘤細胞株，貼壁生長，科室給學(xué)生開實驗就用此細胞，所用培養(yǎng)基為1640，用小牛血清，濃度15%生長較好。培養(yǎng)孵箱為37度，5%的CO2。
  開始將復(fù)蘇的細胞傳到小培養(yǎng)瓶（如25ml），由于細胞分泌各種因子及細胞間的相互作用，因此生長較快，1-2天就可進行傳代（當(dāng)然要達到80-90%的融合）。
  消化采用0.25%的胰酶，在顯微鏡下觀察，看細胞形態(tài)變圓，而且細胞間界限明顯后，或有極少數(shù)細胞漂浮起來就可終止消化。
  吹打時，動作要輕、快，而且吹管中要吸滿液體，這樣就不會產(chǎn)生氣泡，吹打按一定的順序進行，將瓶子徹底吹打，尤其是邊緣和角落。
  傳代，先將此瓶細胞只傳到一個大瓶中，以保證細胞的數(shù)量，小瓶也可保留，繼續(xù)培養(yǎng)。這樣3-4天又可進行傳代。

本人的細胞株購自武漢中國典藏物培養(yǎng)中心（美國ATCC株亞型），培養(yǎng)基是MEM， 10％的小牛血清（購自杭州四季青公司）。傳代要看細胞數(shù)的多少，一般來說10％的細胞，要5天左右，如果90％融合的細胞一傳2，3天子代細胞即可傳 代。傳代：偶用的是25ml培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)基，6mlpbs沖洗3次，加入0.25％的胰酶2－3ml，胰酶均勻蓋滿瓶壁，消化2－5min左右（可以 同時振搖），細胞縮起變圓，浮起，加入培養(yǎng)基2－3ml，不用太精確，吹打成單細胞懸液分瓶即可。室溫下消化即可，因為是成纖維細胞，較為耐受胰酶，消化 時間稍長亦可，要注意mcf-7細胞是一種腫瘤細胞，生長規(guī)律性差，很容易不均勻，要注意吹打的充分性

棄培液－－>以D-Hanks＇液洗兩次－－>0.05％胰酶消化－－>鏡下觀察細胞變圓（約5分鐘）－－>以完全培液（DMEM 10% FCS）終止反應(yīng)－－>吹打，1:3 - 1:4接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
  該細胞系生長速度很快，所以采用1:3 - 1:4接種，而且換液間隔不要超過48h，否則細胞容易脫落下來。

如Molt－4,Hl－60等：這些細胞的特點是懸浮生長，傳代方便，而且適應(yīng)能力強——————好養(yǎng)！
  當(dāng)細胞生長到約2—8×10（6）后，即可認為進入對數(shù)生長期，此時傳代好，一般控制在2－5×10（6）之間，此時狀態(tài)。

直接在細胞懸液中加入一定比例的培養(yǎng)基。比例是根據(jù)您的實驗時間安排而定，此細胞一般24小時左右可以增長一倍數(shù)量，因此，如果現(xiàn)在的濃度為4，您明天要實驗，則可1：1傳，————2×10（6）。明天同一時間大概就是4左右。

生長迅速，必須每天觀察，因此如果明天您要4×10（6），今天為4，就必須以1：2～3的傳。否則明天就已經(jīng)因濃度太大而不易實驗。
  因是懸浮細胞，所以觀察時以大小，圓不圓，顆粒多少，成團情況，培養(yǎng)基顏色來觀察

貼壁細胞，以25ml小方瓶為例，培養(yǎng)液用的是MEM。
  MEM的配制：10%小牛血清，1%雙抗，3%谷氨酰胺，1~1.5%NaHCO3.
  傳代方法：
  1.倒掉培養(yǎng)液，如果細胞臟的話可用PBS洗兩次，否則不用。
  2.胰酶0.25%2ml消化1~3分鐘，容易消化.
  3.倒掉胰酶，加MEM9~12ml,將貼壁細胞搖至懸浮，并用吸管吹勻，一傳三或一傳四。
  4.放置37度，5%CO2孵箱

是一種懸浮細胞：
  1、培養(yǎng)液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，慶大霉素100IU／ml；
  2、培養(yǎng)條件：5％CO2，37度，30％濕度；
  3、細胞復(fù)蘇：要快速將凍存管放入37度水中，不斷輕輕搖晃，直到細胞完全溶解，加入10ml左右的培養(yǎng)液，800～1000rpm，10分鐘離心，之后倒掉液體，加入新的培養(yǎng)基就可以進行培養(yǎng)了；
  4、細胞培養(yǎng)：起初進行傳代時由于細胞剛剛復(fù)蘇，長得比較慢，所以可以3～4天傳一代，傳過兩代后，一般2～3天傳一代，每次傳代后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，在傳過幾代合適的時候可以進行實驗。
  5、細胞凍存：1000rpm離心后，棄去液體，加入含有15％DMSO的凍存液，按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－80℃ 1小時）→液氮。
  6、我在做細胞培養(yǎng)時的一些小經(jīng)驗：
  （1）細胞培養(yǎng)箱在每使用1個月用酒精擦洗一次，這樣可以減少污染；
  （2）雖然說加樣器放在紫外下照射會不準(zhǔn)，但我們還是丟了一把1ml的加樣器在超凈臺，沒有拿出來過，我想這樣也許會減少污染；
  （3）小牛血清我們用的是國產(chǎn)的，所以在一開始的時候加了15％的小牛血清，但細胞總是長不好，后來摸索條件，把小牛血清的量調(diào)到了20％，細胞生長旺盛；
  （4）HEPES雖然貴點，但加上去后細胞會長的不錯；
  （5）在超凈臺操作前要用0.1％的新潔爾滅或75%酒精擦手

細胞放在顯微鏡下觀察，細胞無污染、退縮，等其長滿培養(yǎng)瓶約70%-80%時即可進行傳代操作，具體步驟如下：
  1. 打開瓶蓋，棄上清,2.D-HANK‘S夜（以50ml培養(yǎng)瓶為例，下同）2吸管清洗后棄之；3.加0.25%胰酶2吸管；4.輕搖晃后置入37度溫 箱；5.3-5分鐘后置顯微鏡下觀察，見細胞胞質(zhì)退縮，變圓；6.吸去胰酶，加含10黃的RPMI1640 3吸管；7.用洗管吹打，見細胞脫落，培養(yǎng)液變混，即可吸出加到新的培養(yǎng)瓶中。
  注意事項：若胰酶消化超過時間，見細胞已漂浮，切不可直接倒去上清，可直接加等量的含10黃的RPMI1640，吹打后加到離心管中離心5分鐘，再棄上清，加入培養(yǎng)基進行傳代。

小鼠成纖維細胞。消化過程：倒掉培養(yǎng)基——向培養(yǎng)瓶中加入少量37度預(yù)熱的0.25%胰酶，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶使胰酶浸過瓶底，倒掉胰酶——再向瓶中加入胰酶，加 入量以能覆蓋細胞為宜，1分鐘后倒掉胰酶——將培養(yǎng)瓶置于37度孵箱中——顯微鏡下觀察，細胞開始變形時以含10%小牛血清的DMEM中止消化——吹打成 單細胞懸液，1:2~1:3接種，繼續(xù)培養(yǎng)。
  SKOV3細胞傳代方法：
  自CO2培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)瓶－>超凈工作臺中,以吸管輕輕吹打 有細胞的瓶壁，去除生長不好的細胞－－>棄去培養(yǎng)液－－>加0.04%&<46;  EDTA數(shù)滴 （用0.02%的EDTA不易消化掉） ，浸過細胞－－>置37℃培養(yǎng)箱10min&<46;左右－－>取出，倒置顯微鏡下觀察，細胞變圓回縮，但又未自瓶壁脫落 －－&<46;>超凈工作臺中棄去EDTA－>加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基 －－&<46;>吸管吹打后，1:2或1:3接種。&<46;

通常我是不用EDTA的只用0.25%的胰酶消化一般在細胞約80%匯合時傳代加入一毫升的胰酶后可以不用吸出胰酶（前提是用10%以上濃度的血清 DMEM培養(yǎng)液）加上胰酶直接拍打至細胞脫落加入少許培養(yǎng)液中和后分瓶然后補加培養(yǎng)液 5%CO2孵箱 37度培養(yǎng)效果不錯。

293 貼壁很不牢，可以不加消化液直接吹打下來，但這樣下來的細胞容易聚成團，傳代后形態(tài)不大好看�？梢韵鹊沟襞囵B(yǎng)液，以D-HANK‘S液輕輕沖洗，再加 0.6ml 0.25%胰酶/0.01鞹A，輕輕潤濕細胞后即可棄去，置于鏡下觀察，很快即可見細胞變圓，加入適量完全培養(yǎng)基終止，輕輕吹打即可。這樣細胞既不會消化 過頭，又極盡吹散。

貼壁細胞：在消化傳代過程中，步驟如下：
  用 滴管吸盡舊的培養(yǎng)液－＞用培養(yǎng)基洗一次－＞加入一定量的胰酶（已預(yù)熱）-＞顯微鏡下觀察，待細胞大部分變圓時，回到超靜臺－＞用滴管吸盡酶液－＞加入一定 量的含血清的新培養(yǎng)液－＞反復(fù)吹打細胞－＞再置顯微鏡下觀察，直到細胞全部懸浮起來－＞吸出一部分加入新的培養(yǎng)瓶中－＞*后再補充加入一定量新的培養(yǎng)液， 放入培養(yǎng)箱。
  可用含有血清的DMEM，也可以用含有血清的1640。

以50ml培養(yǎng)瓶為例
  1、細胞貼壁生長，長滿瓶底80％時，膠頭滴管移去培養(yǎng)液，可輕輕吹打，移液時不留培養(yǎng)液殘余
  2、加0.25％胰酶1ml消化37℃約2min，鏡下可見細胞基本圓形脫落，加含血清培養(yǎng)液2ml中止消化，反復(fù)混懸
  3、移入離心管，1200g，5min
  4、棄去上清，加入新培養(yǎng)液5ml，再次吹打混懸細胞，按需要分入新的培養(yǎng)瓶，鏡下可見散在分布圓形細胞
  5、入37℃5％CO2孵箱，半天即可再貼壁。

將Caco-2 細胞培養(yǎng)于高葡萄糖（的DMEM培養(yǎng)基中（ 1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺（L-glutamine）, 培養(yǎng)液含青霉素（ penicillin）10,000U/ml-鏈霉素（streptomycin）10,000ug/ml, 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS））,長于T-75組織培養(yǎng)曲頸瓶中,通入5%CO2（相對濕度90%）,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)介質(zhì)2～3天更換一次,當(dāng)細胞達 到90%融合后，以不含鈣,鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后與胰酶（0.25%）—EDTA（1mM）于37℃一起孵育至分離（約5～10分鐘）。 吹打細胞使之脫落，置離心管中1000rmp離心5分鐘。細胞重新懸浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培養(yǎng)瓶中。即完成傳 代。

37度，5％CO2培養(yǎng)箱。
  消化前所 用物品75％酒精擦拭后放到超凈臺上，紫外照射30min，同時胰酶和1640培養(yǎng)液（10％小牛血清，杭州四季青）75％酒精擦拭后放入37度培養(yǎng)箱平 衡，進無菌室開始傳代時取出。來蘇水托地，整個房間紫外消毒30min。開風(fēng)淋30min（時間寧長勿短啊，有一次弄得我的臉暴皮！半個月才緩過來）。 Bel7402通常都是棄培養(yǎng)液（我通常是倒，覺得用吸管次數(shù)多會增加污染的機會，而我老師意見正好相反，郁悶�。�，加入少量胰酶清洗，棄去后，加入胰酶 2－3ml，培養(yǎng)箱內(nèi)放置3min左右，取出，加入培養(yǎng)液中和胰酶，輕輕吹打即可。
  ECV－304培養(yǎng)條件同時。操作的時候步驟基本相同，只是加入胰酶消化的時間比Bel-7402稍微長1－2min。

包括SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，幾種細胞的特性不完全一樣，但是我的傳代的步驟是基本一致的：細胞生長至80%匯合時傳代， 先倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)先加好雙抗的生理鹽水或PBS 5-10ml（100ml培養(yǎng)瓶）后輕輕搖晃數(shù)次后倒掉，加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其分布均勻（這一點很重要，一定要注意工作臺是否平 整，否則容易造成胰酶分布不均勻而細胞消化不同步），待細胞間隙變大時終止消化，加含10%血清的培養(yǎng)液（我用的是1640）4ml輕柔吹打，再按照需傳 代的比例（1：2或1：3）補足培養(yǎng)液后分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中。若細胞碎片較多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培養(yǎng)液吹打后500rpm離心 5min，再用培養(yǎng)液重懸分瓶。消化所需的具體時間依細胞的種類和狀態(tài)而定，也和細胞的匯合程度有關(guān)，一般是80%匯合時*容易消化，若細胞長得太滿，消 化時間要適當(dāng)延長，必要時可以將培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱內(nèi)消化。另外，一次性培養(yǎng)瓶要比玻璃培養(yǎng)瓶所需的消化時間稍長。
  胰腺癌細胞我所養(yǎng)的是CAP，感 覺不太好伺候，尤其是傳代時很困難。我一般是在倒掉培養(yǎng)液后，加生理鹽水或PBS沖洗，而后加一次胰酶作用3-5分鐘，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶 繼續(xù)消化，這樣加兩次的效果好一些，但是吹打的時候還是很困難，總感覺細胞的貼壁能力太強了，明明看見細胞已經(jīng)變圓了，可就是吹不下來�，F(xiàn)在想想可能在胰 酶中加EDTA會好一些。